LABORATORIO DE ESPECTROFOTOMETRÍA (EN PROTEINAS COMO LECHE, ALBÚMINA Y SANGRE)

La ley de Beer es una relación matemática ideal que contiene ciertas limitaciones. Desviaciones de la misma, es decir circunstancias en las cuales la relación entre la absorbancia y la concentración de una muestra no es lineal pueden ocurrir cuando:

1. La concentración de la solución a medir es muy elevada

2. La luz incidente no es monocromática

3. La cantidad de luz absorbida por el solvente es significativa con respecto a la sustancia en solución que se desea medir

4. Hay luz transmitida que no es generada a partir de la sustancia a cuantificar

5. Los lados de la celda donde se deposita la muestra no son paralelos

6. Mezcla de varias especies químicas que absorben luz de la misma longitud de onda: las especies “competirán” entre sí por la luz, cada una con diferente absortividad.

Fundamento de la prueba

El método de Biuret sirve para determinar proteínas totales en una muestra, ya que permite detectar la presencia de compuestos con dos o más enlaces peptídicos, por tanto se utiliza para identificar todas las proteínas y péptidos cortos, excepto los dipéptidos.

LEY DE BEER – LAMBERT

Parte 1

  1. Preparar una solución stock de KMnO4 1mM
  2. Calibrar el espectrómetro con agua
  3. Leer la trasmitancia (T)de la muestra partiendo desde una longitud de onda de 510 nm a 580nm, en intervalos de 5nm
  4. Calcular a partir del valor de trasmitancia(T) el valor de la absorbancia (A)
  5. Graficar la A vs Longitud de onda y determinar el valor máximo de absorción experimental.
  6. B.      Parte 2
  7. Realizar disoluciones en serie de la muestra de KMnO4
  8. Calibrar el espectrofotómetro ajustando a cero con agua destilada
  9. Ajustar el colorímetro a la longitud de onda de máxima absorción que determino anteriormente y lea los valores de T de las disoluciones preparadas
  10. Graficar los datos A vs Concentración  y T vs concentración  y corregir con mínimos cuadrados

PROTEINAS PLASMATICAS SANGUINEAS

  1. Parte 1. TOMA DE LA MUESTRA Y OBTENCIÓN DE PROTEINAS
  1. Extraer 10 mL de sangre, recoger en un tubo de cetriguga
  2. Dejar coagular hasta completar la coagulación
  3. Separar el coagulo de las paredes del tubo con un agitador
  4. Centrifugar los tubos 10 minutos a 3000 rpm
  5. El sobrenadante es el suero
  6. Repetir el anterior procedimiento pero utilizando anticoagulante y asi obtener el plasma

NOTA: Utilizar guantes y lentes protectores por bioseguridad

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