Tipos de HPLC

Cromatografía de reparto o partición líquido-líquido:

Esta técnica se basa en el reparto de los solutos o analitos sobre fases móvil y estacionaria líquidas, inmiscibles entre sí. La separación selectiva de éstos se debe al diferente grado de solubilidad en las diferentes fases.

 A su vez, la cromatografía de partición se puede clasificar en dos tipos según las polaridades relativas de la fase móvil y estacionaria:

- Fase normal: cuya fase móvil es apolar y fase estacionaria polar. Adecuada para separar compuestos polares.

- Fase reversa o inversa: con fase móvil polar y fase estacionaria apolar. Adecuada para separar mezclas de compuestos orgánicos neutros o cargados de bajo peso molecular.

Cromatografía de adsorción líquido-sólido:

Es aquella que presenta como fase estacionaria un adsorbente sólido, ya sea sílice o alúmina, donde el analito compite con la fase móvil por los sitios de la superficie y su retención se debe a las fuerzas de adsorción. La única variable que altera el coeficiente de partición de los analitos es la composición de la fase móvil.

Cromatografía de intercambio iónico:

Consiste en la separación de moléculas en función de las cargas que poseen gracias a la presencia de una fase estacionaria a modo de matriz insoluble a la que se han unido covalentemente grupos cargados. La afinidad diferencial de los solutos por esos grupos cargados nos permitirá una separación eficaz de los mismos.

Cromatografía de exclusión molecular:

La separación de los solutos en esta técnica se basa en la capacidad del analito de penetrar en los poros de la matriz de la columna, de modo que si la molécula es de un tamaño mayor al poro no experimentan retención y viajan a la velocidad de la fase móvil, mientras que las que sean menores al límite de inclusión de la columna entrarán en la matriz y su tiempo de retención será mayor.

COMPARACIÓN HPLC Y GC

Características de ambos métodos:

- Eficaz, muy selectivo y ampliamente aplicable

- Uso de muestras pequeñas

- Método no destructivo

- Adaptación al análisis cuantitativo

Ventajas de la técnica de HPLC:

- Separación de muestras no volátiles y térmicamente inestables

- Aplicación a iones inorgánicos.

Ventajas de la técnica de CG:

- Rápida

- Alta resolución

- Acoplamiento fácil con espectrometría de masas.

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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICACIA

Dentro de los tipos de cromatografía que se han desarrollado, y englobada dentro de las cromatografías cuya fase móvil está constituida por un líquido, destaca la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC, High Perfomance Liquid Chromatography), también denominada de Alta presión. Esta técnica de separación y análisis consiste en hacer pasar una muestra líquida o sólida disuelta en un disolvente adecuado junto con una fase líquida móvil por una columna cromatográfica. Esa columna se caracteriza por encontrarse muy empaquetada, por lo que es necesario ejercer elevadas presiones para que el proceso no se alargue excesivamente en el tiempo. La separación de los componentes de la mezcla se efectúa gracias a interacciones de éstos con la fase móvil y estacionaria. Dependiendo del tipo de columna y de la interacción de los solutos con la fase estacionaria podemos distinguir:

- Cromatografía de adsorción líquido-sólido.

- Cromatografía de reparto líquido-líquido.

- Cromatografía de intercambio iónico.

- Cromatografía de exclusión molecular.

Previa a la breve descripción de los tipos de HPLC y sus características, describiremos el equipamiento necesario para llevarlas acabo.

Equipamiento: El disolvente elegido ha de ser compatible con la muestra a analizar y ofrecer unas buenas características de separación, para ello pueden utilizarse eluciones isocráticas, un solo disolvente o una mezcla fija de ellos, o variar su composición a lo largo del proceso en las llamadas eluciones con gradiente. En ambos casos se necesitan depósitos adecuados para albergar los disolventes. Generalmente, estos reservorios se encuentran asociados a una serie filtros y mecanismos de eliminación de gases que excluyen posibles partículas y gases que pueden afectar al proceso cromatográfico obstruyendo la columna y/o alterando los registros.

La fase estacionaria en HPLC presente en la columna se ha caracterizar por ser estable y resistente a altas presiones. Generalmente estos rellenos suelen ser inorgánicos como partículas de sílice, alúmina (óxido de aluminio, Al2O3) o vidrio. En el caso de cromatografía líquido-líquido la fase estacionaria es una película líquida que reviste el material empaquetado.

En la salida de la columna podemos encontrar un dispositivo de detección que nos identificará los solutos presentes en la fase móvil. Han de ser sensibles a pequeñas variaciones, deben tener un mínimo ruido y deriva, rápida respuesta en un amplio rango lineal y ser insensibles a cambios de flujo y temperatura. Dependiendo de la naturaleza de la muestra el dispositivo de detección elegido variará. Los detectores empleados comúnmente son aquellos que miden la absorción de radiación UV/visible o bien los detectores electroquímicos.

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CROMATOGRAFÍA DE GASES

La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica que se emplea para separar compuestos orgánicos volátiles, siendo el método más rápido y sencillo para la identificación de los constituyentes de una mezcla. Implica el uso de una columna cromatográfica especial en cuyo inicio se inyecta la muestra vaporizada que se transporta a lo largo de la columna impulsada por una fase móvil gaseosa inerte. Los componentes de dicha muestra se separan debido a las diferencias en su perfil de partición entre la fase móvil gaseosa y la fase estacionaria.

Tipos de cromatografía de gases:

Dependiendo del estado de la fase estacionaria, podemos distinguir:

- Cromatografía gas – líquido: la fase estacionaria es un líquido no volátil inmovilizado sobre la superficie de un soporte sólido inerte. La velocidad de migración de un analito está determinada por su distribución entre la fase líquida inmovilizada y la fase gaseosa. La temperatura, la volatilidad del analito y su solubilidad en la fase estacionaria son los factores que regulan su retención.

- Cromatografía gas − sólido: se basa en la adsorción de sustancias gaseosas sobre superficies sólidas. Los coeficientes de distribución son generalmente mucho mayores que en el caso de la cromatografía gas – líquido. Debido a esto, la cromatografía gas – sólido es útil para la separación de especies que no se retienen en la anterior, tales como los componentes del aire, sulfuro de hidrógeno, disulfuro de carbono, óxidos de nitrógeno, monóxido de carbono, dióxido de carbono y gases nobles.

Las características ideales de un detector en cromatografía de gases son:

1. Sensibilidad adecuada. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se encuentran en el intervalo de 10−8 a 10−15 g de analito/s.

2. Una respuesta lineal para los analitos que se extienda a varios órdenes de magnitud.

3. Buena estabilidad y reproducibilidad.

4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400 °C.

5. Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal.

6. Alta fiabilidad y fácil manejo.

7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta selectiva y altamente predecible para una o más clases de analitos.

8. No ser destructivo de la muestra.

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Teoría de la cromatografía en columna

A medida que hacemos pasar la fase móvil a través de la estacionaria los componentes de la muestra se van separando poco a poco. Esa separación puede ser registrada mediante un dispositivo de detección capaz de originar un cromatograma, gráfico que representa la repuesta del detector a modo de picos en función del tiempo o volumen de elución.

En cromatografía se define la resolución entre dos picos como:

 

A su vez, la resolución para un soluto puede ser expresada en términos de factor de selectividad α, factor de retención o capacidad k’ y el número de platos N:

El factor de capacidad k’ es directamente proporcional a su relación de distribución, que a su vez, es proporcional a la constante de distribución de equilibrio del soluto. En la cromatografía gaseosa el aumento no selectivo del factor de capacidad se consigue reduciendo la temperatura de la columna; con temperaturas más bajas, la presión de vapor del soluto disminuye, asegurando una mayor permanencia en la fase estacionaria y el consiguiente incremento del factor de capacidad. En la cromatografía líquida, el cambio de fuerza del disolvente de la fase móvil es la forma más sencilla para variar k. Cuando ésta es baja, los solutos pasan proporcionalmente más tiempo en la fase estacionaria mejorando así sus factores de capacidad. El aumento de volumen de la fase estacionaria también se traduce en el aumento de k’.

 

 

 

 

 

 

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METODOS CROMATOGRAFICOS: CROMATOGRAFIA DE GASES Y LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION

La cromatografía es un método de separación y análisis basado en el empleo de una fase estacionaria y una móvil. Los componentes de una muestra se hacen pasar por una fase estacionaria mediante el flujo de una fase móvil de manera que las sustancias se distribuyen entre las dos fases; aquellos solutos cuya relación de distribución sea favorable a la fase estacionaria quedan retenidos por ésta, mientras que los solutos que se encuentran preferentemente en la fase móvil serán los primeros en eluir. De esta forma los solutos serán separados en orden creciente a sus coeficientes de distribución con respecto a la fase estacionaria.

Tipos de cromatografía:

Los métodos cromatográficos pueden ser clasificados:

1) Según el dispositivo utilizado para conseguir poner en contacto la fase estacionaria y fase móvil:

- Cromatografía en columna: consiste en columnas huecas de longitud y diámetro variable en cuyo interior encontramos la fase estacionaria. La fase móvil se hace pasar por ellas ya sea por gravedad o por aplicación de presión.

- Cromatografía plana: la fase estacionaria se encuentra sujeta por una placa plana o en papel (cromatografía en capa fina y en papel, respectivamente) y la fase móvil se desplaza por ella mediante capilaridad o influenciada por la gravedad.

2) Según los estados de las fases implicadas, en especial de la fase móvil:

- Cromatografía de gases: gas-líquido o gas-sólido

- Cromatografía de líquidos: líquido-sólido, líquido-líquido, intercambio iónico, exclusión molecular.

- Cromatografía de fluidos supercríticos (cualquier sustancia que se encuentre en condiciones de presión y temperatura superiores a su punto crítico).

3) Según el mecanismo de interacción del soluto con la fase estacionaria:

- Cromatografía de adsorción: el soluto presente en una fase móvil líquida o gaseosa se adsorbe a las partículas sólidas de la fase estacionaria. La separación de los diferentes solutos se debe al equilibrio entre las fases estacionaria y móvil.

- Cromatografía de reparto: se vale de una fase estacionaria líquida que forma una película sobre un soporte sólido. La distribución del soluto vienen dada por el equilibrio entre la fase estacionaria y móvil.

- Cromatografía de intercambio iónico: consiste en hacer pasar una fase móvil líquida sobre una fase estacionaria que presenta grupos iónicos en su superficie de modo que los iones de signo opuesto quedarán retenidos por fuerzas electrostáticas.

- Cromatografía de exclusión molecular: las moléculas de cierto tamaño presente en la fase móvil líquida o gaseosa son excluidas por la matriz que presenta poros de un determinado tamaño, impidiendo así su paso por el gel y, por tanto, acortando su tiempo de retención.

- Cromatografía de afinidad: emplea interacciones específicas entre una clase de moléculas de soluto y una segunda molécula unida covalentemente a la fase estacionaria. (ejemplo: anticuerpo-proteína).

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Propiedades intensivas

Las propiedades intensivas:  son aquellas que no dependen de la cantidad de sustancia o del tamaño de un sistema, por lo que el valor permanece inalterable al subdividir el sistema inicial en varios subsistemas, por este motivo no son propiedades aditivas.

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Métodos cromatográficos

Los métodos químicos han sido utilizados tradicionalmente, ya que no requieren intrumentos muy complejos (tan sólo pipetas, buretas, matraces, balanzas entre otros) Los métodos fisicoquímicos, sin embargo, requieren un intrumental más sofisticado, tal como equipos de cromatografía, cristalografía, etc.

El estudio de los métodos químicos está basado en el equilibrio químico, que puede ser de los siguientes tipos:

equilibrio ácido-base
equilibrio redox
equilibrio de solubilidad
equilibrio de complejos

PREPARACION Y ESTANDARIZACIÓN DE SOLUCIONES (HIDROXIDO DE SODIO 0.1 N)

El NaOH es un sólido, una solucion estandar de esta base no puede ser preparada por pesado directo , ya que esta sustancia es higroscopica y absorbe el CO2 de el ambiente por lo que siempre esta impurificada de Na2CO3 de agua.

Una solucion de NaOH que se va usar en valoraciones de acido base no debe tener carbonatos porque varia sus propiedades.

Calculos Previos

El NaOH tiene 99% de pureza, realizamos el calculo correspondiente de la siguiente manera:

PROCEDIMIENTO REALIZADO

a.- Pesar en la balanza 4.08 g de NaOH impuro.

b.- Transferir el NaOH pesado a una fiola aforada de 500ml y echar agua bidestilada hasta el enrase.

c.- Tapar y homogenizar.


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Métodos electroanalíticos

Potenciométricas: Medición de la diferencia de potencial entre los electrodos de una celda   formada por un electrodo sensible al analito (electrodo indicador) y un electrodo patrón (electrodo de referencia).

  1. Amperométricas (miden una intensidad de corriente con dependencia lineal de la concentración de analito).
  2. Voltamperométicas (miden la función. E= f(i), que se relaciona con la concentración de analito)
  3.  Coulombimétricas: miden los coulombios precisos para electrolizar el analito.

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Métodos fisicoquímicos (se basan en interacciones físicas) o instrumentales

Métodos espectrométricos : Según la naturaleza de la excitación medida

El tipo de espectrometría depende de la cantidad física medida. Normalmente, la cantidad que se mide es una intensidad de energía absorbida o producida. Se pueden distinguir estos tipos de espectrometría según la naturaleza de la excitación:

* Electromagnética. Interacciones de la materia con radiación electromagnética como la luz.

* De electrones. Interacciones con haces de electrones. La espectroscopia Auger implica inducir el efecto Auger con un haz de electrones. En este caso la medida implica la energía cinética del electrón como variable.

* De masa. Interacción de especies cargadas con campos magnéticos y/o eléctricos, dando lugar a un espectro de masas. El término “espectroscopia de masas” está anticuado, ya que la técnica es principalmente una forma de medida, aunque produzca realmente un espectro para la observación. Este espectro tiene la masa (m) como variable, pero la medida es esencialmente de la energía cinética de la partícula.

* Acústica. Frecuencia de sonido.

* Dieléctrica. Frecuencia de un campo eléctrico externo.

* Mecánica. Frecuencia de un estrés mecánico externo, por ejemplo una torsión aplicada a un trozo de material.

* De absorción. Usa el rango de los espectros electromagnéticos en los cuales una sustancia absorbe. Incluye la espectrometría de absorción atómica y varias técnicas moleculares, como la espectrometría infrarroja y la resonancia magnética nuclear (RMN).

* De emisión. Usa el rango de espectros electromagnéticos en los cuales una sustancia irradia (emite). La sustancia primero debe absorber la energía. Esta energía puede ser de una variedad de fuentes, que determina el nombre de la emisión subsiguiente, como la luminescencia. Las técnicas de luminescencia moleculares incluyen la espectrofluorimetría.

* De dispersión. Mide la cantidad de luz que una sustancia dispersa en ciertas longitudes de onda, ángulos de incidencia y ángulos de polarización. El proceso de dispersión es mucho más rápido que el proceso de absorción/emisión. Una de las aplicaciones más útiles es la espectroscopia Raman.

Según el proceso de medida:

La mayoría de los métodos espectroscópicos se diferencian en atómicos o moleculares según si se aplican a átomos o moléculas. Junto con esta diferencia, se pueden distinguir los siguientes tipos de espectrometría según la naturaleza de su interacción:

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Volumetría ácido- base

También conocida como valoración ácido-base, titulación ácido-base, o incluso, valoración de neutralización, es un tipo de técnica utilizada para realizar análisis de tipo cuantitativo, para hallar la concentración de una disolución, en la cual se encuentra una sustancia que realiza el papel de ácido, o de base, que a su vez se neutraliza con otro ácido o base, del cual conocemos su concentración.

Este método, ampliamente utilizado, se encuentra basado en una reacción ácido-base, también llamada, reacción de neutralización, donde interactúan el analito, o sustancia de la cual no conocemos su concentración, y la sustancia conocida llamada, valorante.

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